UJI AKTIVITAS ENZIM α-AMILASE YANG DIHASILKAN OLEH Bacillus subtilis

Latar Belakang

Pati merupakan polisakarida yang terakumulasi didalam jaringan tanaman. Pati merupakan campuran daru dua polimer glukosa yaitu amilosa dan amilopektin. Struktur amilosa berupa rantai lurus tidak bercabang yang tersusun dari unit D-glukosa dengan ikatan glikosida α-1,4 sedangkan amilopektin memiliki dua struktur yaitu rantai  utama berupa rantai lurus seperti amilosa dan rantai cabang yang terkait dengan rantai utama melalui ikatan glikosida α-1,6. Pati memiliki nilai komersial. Pati digunakan sebagai bahan baku dalam berbagai industri makanan, kertas, tekstil, farmasi, dan lain sebagainya. Tahap penting dalam penggunaan pati di berbagai industri adalah hidrolisis pati. Produk yang dihasilkan dalam hidrolisis pati adalah glukosa atau maltosa, maltodekstrin, dan derivatnya (Bertolini 2010).

Hidrolisis amilum menjadi monomer glukosa dapat dilakukan oleh enzim amilase. Enzim amilase terdiri dari α-amilase, β-amilase, dan glukoamilase. α-amilase (EC 3.2.1.1) adalah endoenzim ekstraseluler yang memutus ikatan α-1,4 glukosidik pada amilum menghasilkan α-maltosa.  β-amilase (EC 3.2.1.2) adalah eksoenzim ekstraseluler yang memutus ikatan α-1,4 glukosidik dari akhir non pereduksi menghasilkan β-maltosa. Glukoamilase (EC 3.2.1.3) berfungsi memutus ikatan α-1,4 dan α-1,6 glukosidik dari akhir non pereduksi menghasilkan β-glukosa (Park 2008).

Sumber enzim amilase adalah saliva. Selain itu, pada beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa mikroba juga dapat menghasilkan enzim amilase. Beberapa spesies bakteri yang telah diketahui mampu menghasilkan amilase diantaranya Bacillus flavothermus, B. subtilis, B. cereus, Bacillus sp., dan vibrio sp. (Annamalai 2011). Berdasarkan hal tersebut maka enzim amilase dapat diproduksi secara cepat dan dalam jumlah banyak dengan memanfaatkan kultur mikroba.

Aktivitas enzim amilase dapat diukur dari substrat yang digunakan maupun dari produk yang dihasilkan. Metode kolorimetri dapat digunakan dalam mengukur kadar gula pereduksi sebagai produk dari hidrolisis pati. Salah satu reagen yang digunakan dalam metode kolorimetri tersebut adalah 3.5-dinitrosalicylic acid (DNS).  Prinsip reagen DNS adalah berikatan dengan gula pereduksi membentuk 3-amino nitrosalicylic acid dan gula teroksidasi (Wood et al 2012). Reaksi akan terjadi jika ditempatkan dalam air yang mendidih (105^oC) dan reaksi akan berhenti jika ditempatkan dalam air dingin (Gocalves et al 2010). Aktivitas enzim amilase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang digunakan dalam menghasilkan 1 µmol gula pereduksi maltosa per menit (Bano et al 2011).

Enzim akan diproduksi oleh sel jika terdapat substrat. Bacillus subtilis telah diketahui mampu menghasilkan enzim α-amilase. Pada praktikum ini dilakukan pembuatan kultur Bacillus subtilis dalam medium Nutrient Broth yang ditambah dengan pati dan pembuatan kultur Bacillus subtilis dalam medium Nutrient Broth tanpa penambahan pati. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diamati perbedaan fisiologi dari Bacillus subtilis yang ditumbuhkan dalam medium yang berbeda. 

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk menguji aktivitas enzim α-amilase yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis (kode S dan NS), mengukur kadar protein dan menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase. 

  

METODE

Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah supernatan hasil kultur cair bakteri B. subtilis pada medium Nutrient Broth yang ditambah dengan pati terlarut 1% (kode S) dan kultur cair bakteri B. subtilis pada medium Nutrient Broth tanpa penambahan pati terlarut 1%. Pati terlarut 1%, akuades, protein standar BSA (Bovin Serum Albumin), reagen bradford (komposisi 0.025 gram coomassie brilliant blue G250, 12.5 mL etanol pa 95%, 25 mL asam ortofosfat dan aquades), maltosa 0.05 gram, 2 gram NaOH, 36.4 gram Rochele (K, Na tartrat), dan 2 gram DNS.

Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet volumetrik, vorteks, beaker glass, erlenmeyer, gelas ukur, mikropipet, spektrofotometri, centrifuge, kuvet, eppendorf, dan neraca analitik.

Prosedur Praktikum

Praktikum ini dibagi menjadi 5 tahap yaitu pembuatan kurva standar untuk enzim, uji aktivitas enzim amilase, pembuatan kurva standar untuk protein, pengukuran kadar protein, dan penentuan aktivitas spesifik enzim amilase. 

Pembuatan Kurva Standar Maltosa

Pembuatan kurva standar dilakukan dengan membuat konsentrasi larutan standar maltosa. Perbandingan akuades dan maltosa yang digunakan dalam membuat kurva standar adalah 1:0, 0.9:0.1, 0.8:0.2, 0.7:0.3, 0.6:0.4, 0.5:0.5. Semua konsentrasi larutan standar selanjutnya ditambah dengan 1 mL pati terlarut 1% kemudian diivorteks lalu diinkubasi pada suhu 30^oC selama 15 menit. Selanjutnya masing-masing sediaan ditambah dengan 2 mL pereaksi DNS lalu diinkubasi pada air mendidih selama 5 menit. Setelah dingin masing-masing sediaan diukur nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 550 nm.

Uji Aktivitas Enzim α-Amilase

Bahan yang digunakan dalam uji aktivitas enzim amilase adalah supernatan yang berisi enzim ekstrak kasar. Supernatan diperoleh dari hasil sentrifugasi masing-masing kultur cair B.subtilis (kode S dan NS). Sentrifugasi kultur cair dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Uji aktivitas enzim amilase dilakukan dengan beberapa persiapan sebagai berikut.

1.   Persiapan sampel. Penyiapan sampel uji dilakukan dengan pengambilan 1 mL pati terlarut 1% sebagai substrat kemudian ditambah dengan 1 mL supernatan kode S, dan pada tabung reaksi yang berbeda diisi 1 mL pati terlarut 1% ditambah dengan 1 mL supernatan kode NS.

2.    Persiapan blanko. Blanko dibuat dengan pengambilan 1 mL pati terlarut 1% ditambah dengan 1 mL akuades. Blanko dibuat 2 kali yaitu sebagai blanko untuk sampel S dan blanko untuk sampel NS.

3.   Persiapan kontrol. Kontrol dibuat dengan pengambilan 1 mL pati terlarut 1%. Kontrol dibuat 2 kali yaitu sebagai kontrol untuk sampel S dan kontrol untuk sampel NS.

Pada sampel, blanko, dan kontrol masing-masing dihomogenkan dengan menggunakan vorteks lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu 30^oC. Setelah itu sampel, blanko, dan kontrol ditambah pereaksi DNS sebanyak 1 mL. Khusus pada kontrol, satu tabung ditambah dengan 1 mL supernatan kode S dan tabung lain ditambah dengan 1 mL supernatan kode NS.  Selanjutnya semua sediaan yaitu sampel, blanko, dan kontrol diinkubasi pada air mendidih selama 5 menit. Setelah itu dibiarkan dingin dan nilai absorbansinya diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 540 nm. Rumus menentukan aktivitas enzim sebagai berikut.

Keterangan

X₂ = gula pereduksi akhir

X₁ = gula pereduksi awal

Pembuatan Kurva Standar BSA

Standar protein yang digunakan dalam praktikum ini adalah BSA. Sebanyak 11 tabung reaksi diisi dengan perbandingan BSA dan aquades yang berbeda yaitu 0:1; 0.1:0.9; 0.2:0.8; 0.3:0.7; 0.4:0.6; 0.5:0.5; 0.6:0.4; 0.7:0.3; 0.8:0.2; 0.9:0.1; 1:0, sehingga setiap tabung reaksi berisi 1 mL campuran akuades dan BSA. Selanjutnya diambil 60 µL dari setiap tabung kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi lain yang bersih. Setelah itu masing-masing tabung ditambahkan 3 mL reagen Bradford kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks lalu didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit agar terjadi reaksi antara reagen dengan protein. Absorbansi diukur dengan panjang gelombang 595 nm.

Pengukuran Kadar Protein

Kadar protein yang diukur dalam praktikum ini adalah protein yang tedapat didalam supernatan kode S dan NS. Masing-masing protein diambil sebanyak 1 mL kemudian masing-masing ditambahkan 5 mL reagen Bradford. Selain itu dilakukan pembuatan blanko berisi 1 mL akuades kemudian ditambah dengan 5 mL Bradford. Selanjutnya sampel dan blanko dihomogenkan menggunakan vorteks kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 595 nm. Hasil absorbansi pada masing-masing protein sampel dikurangi dengan nilai absorbansi blanko kemudian disubtitusikan kedalam rumus persamaan regresi sehingga akan didapatkan kadar protein terlarutnya.

Pengukuran Aktivitas Spesifik Enzim

Pengukuran aktivitas spesifik enzim didasarkan pada data yang telah diperoleh yaitu unit aktivitas enzim dan kadar protein. Rumus aktivitas spesifik enzim adalah aktivitas enzim dibagi dengan kadar protein.

HASIL

Kurva Standar Maltosa

   Nilai-nilai absorbansi yang dihasilkan dari pembacaan spektrofotometri pada larutan standar digunakan untuk membuat kurva standar. Kurva standar yang terbentuk menunjukkan nilai R² sebesar 0.9618 dan persamaan regresi yang didapatkan adalah Y=0.8983x + 0.2658, dapat dilihat pada Gambar 1.

Persamaan regresi tersebut selanjutnya digunakan untuk menentukan kadar gula pereduksi (x) yaitu dengan cara subtitusi nilai absorbansi terkoreksi (setelah dikurangi dengan nilai absorbansi blanko yaitu 0.071 untuk sampel S dan 0.147 untuk sampel NS) pada masing-masing sampel dan kontrol kedalam persamaan regresi sebagai Y. Nilai-nilai absorbansi tersebut diperoleh dengan pengenceran 3 kali. Kadar gula pereduksi yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk menghitung aktivitas enzim amilase. Kadar gula pereduksi sampel merupakan kadar gula pereduksi akhir (X₂) sedangkan kadar gula pereduksi kontrol merupakan kadar gula pereduksi awal (X₁). Tabel 1 menunjukkan kadar gula pereduksi pada masing-masing sampel. 

Tabel 1 Kadar Gula Pereduksi

Kode	Nilai Absorbansi		Kadar gula pereduksi  (mg/mL (X2 – X1)
	Sampel (X2)	Kontrol (X1)
S	0,310	0,249	0,067
NS	0,029	0,134	0

Aktivitas Enzim α-Amilase

Kadar gula pereduksi (X₂ – X₁) yang didapatkan pada masing-masing sampel selanjutnya dimasukkan kedalam rumus aktivitas enzim. Tabel 2 menunjukkan aktivitas enzim amilase pada sampel S dan NS. 

Tabel 2 Aktivitas Enzim α-Amilase

Kode	Gula pereduksi (mg mL-1)	Aktivitas enzim (U mL-1)
S	0.067	0.056
NS	0	0

Kurva Standar Protein BSA dan Kadar Protein Sampel

Nilai-nilai absorbansi pada protein standar digunakan untuk membuat kurva standar. Kurva standar yang dibuat dari protein standar BSA dapat dilihat pada Gambar 2. 

Nilai R² yang dihasilkan dari kurva standar adalah 0.9571. Persamaan regresi yang didapatkan dari kurva standar BSA yaitu Y=0.4976x + 0.0498 Persamaan tersebut selanjutnya digunakan untuk menentukan kadar protein sampel (x) yaitu dengan cara subtitusi nilai absorbansi dari masing-masing protein sampel ke dalam persamaan regresi sebagai Y. Nilai absorbansi protein sampel S dan NS dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Kadar Protein

Kode	Nilai absorbansi		Kadar protein (mg/mL)
	Sampel	Blanko
S	0,293	0,175	0,137
NS	0,238		0,027

Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase

Aktivitas enzim dan kadar protein yang telah diketahui selanjutnya digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim. Rumus aktivitas spesifik enzim adalah aktivitas enzim dibagi dengan kadar protein. Tabel 4 menunjukkan aktivitas spesifik enzim pada sampel S dan NS.

Tabel 4 Aktivitas Spesifik Enzim α- Amilase

Kode	Aktivitas enzim (U mL-1)	Kadar protein (mg mL-1)	Aktivitas Spesifik (U mg-1)
S	0,039	0,137	0,409
NS	0	0,027	0

PEMBAHASAN

Bacillus subtilis merupakan bakteri yang telah diketahui mampu menghasilkan enzim α-amilase secara ekstraseluler. B. subtilis akan mensintesis enzim untuk mendegradasi substrat (sumber karbon) hanya ketika substrat tersebut tersedia dalam lingkungan sel (Madigan et al. 2015). Sistem tersebut dikenal sebagai inducible system. Hal itu juga didukung oleh hasil praktikum yang menunjukkan bahwa supernatan hasil kultur cair bakteri B. subtilis dalam medium yang mengandung pati (kode S) mengandung enzim α-amilase dengan aktivitas enzim sebesar 0.056 U mL^-1, sedangkan supernatan hasil kultur cair bakteri B. subtilis tanpa penambahan pati (kode NS) tidak mengandung enzim amilase sehingga aktivitas enzim yang dihasilkan 0 U mL^-1.

Pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan melalui dua cara yaitu berdasarkan produk dan berdasarkan substrat. Pada praktikum ini dilakukan pengukuran enzim berdasarkan produk yang dihasilkan. Produk yang dihasilkan merupakan maltosa yaitu gula pereduksi hasil hidrolisis pati oleh enzim α-amilase. Kadar gula pereduksi dalam sampel S adalah sebesar 0.067 mg mL^-1, sedangkan pada sampel NS tidak mengandung gula pereduksi karena tidak ada substrat amilum dan tidak ada enzim α-amilase yang dihasilkan oleh B. subtilis. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri yaitu dengan menggunakan reagen 3.5-dinitrosalicylic acid (DNS).  Prinsip reagen DNS adalah berikatan dengan gula pereduksi membentuk 3-amino nitrosalicylic acid dan gula teroksidasi (Wood et al 2012).

Enzim merupakan protein sehingga enzim dapat diukur berdasarkan kadar proteinnya. Pengukuran kadar protein yang dilakukan dalam praktikum ini menggunakan metode Bradford. Metode Bradford merupakan metode kolorimetri dye-binding yaitu terbentuknya kompleks antara asam amino penyusun protein  dengan Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB G250) dalam kondisi asam. CBB G250 akan berwarna biru ketika berikatan dengan protein (kompleks pewarna-protein). Jumlah ikatan antara pewarna dengan protein dapat diukur pada panjang gelombang 595 nm. Kelompok asam sulfonat anion pada pewarna akan berpasangan dengan bagian kation pada asam amino lisin, arginin, histidin. Selain itu, pewarna juga dapat berikatan dengan asam amino nonopolar (fenilalanin, triptofan, dan tirosin) pada bagian hidrofobik (Sapan et al. 1999; Georgiou et al. 2008). Pada sampel S diketahui kadar protein yang terukur sebesar 0.137 mg mL^-1, sedangkan kadar protein sampel NS sebesar 0.027 mg mL^-1. Hal tersebut menunjukkan bahwa kadar protein yang terukur pada sampel S pasti termasuk kadar enzim α-amilase, sedangkan kadar protein pada sampel NS bukan enzim α-amilase namun protein lain dari medium.

Hasil pengukuran aktivitas enzim dan kadar protein selanjutnya dapat digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase. Aktivitas spesifik enzim α-amilase pada sampel S diketahui sebesar 0.409 U mg^-1, sedangkan sampel NS tidak memiliki aktivitas spesifik enzim karena sampel NS diketahui tidak menghasilkan enzim α-amilase.

SIMPULAN

Simpulan dalam praktikum ini adalah sampel S mengandung enzim α-amilase sedangkan sampel NS tidak mengandung enzim α-amilase. Aktivitas enzim α-amilase pada sampel S sebesar 0.056 U mL^-1, sedangkan sampel NS tidak memiliki aktivitas enzim. Kadar protein sampel S sebesar 0.137 mg mL^-1, sedangkan kadar protein sampel NS sebesar 0.027 mg mL^-1. Aktivitas spesifik enzim α-amilase pada sampel S adalah 0.409 U mg^-1, sedangkan pada sampel NS tidak memiliki aktivitas spesifik enzim α-amilase.