PENGUKURAN KADAR PROTEIN DENGAN MENGGUNAKAN METODE BRADFORD

Protein merupakan biopolimer yang tersusun dari sejumlah asam amino tertentu yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi sel. Analisis protein dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif digunakan untuk mengetahui keberadaan protein dalam suatu bahan, sedangkan analisis kuantitatif digunakan untuk mengetahui kadar protein yang terkandung dalam suatu bahan. Analisis biokimia protein didasarkan pada akurasi kadar protein. Terdapat berbagai metode yang dapat digunakan untuk mengukur kadar protein terlarut diantaranya adalah Biuret, Bradford, Lawry, Bicinchoninic acid, dan Derivat Amin (Noble dan Bailey 2009).

Pada praktikum ini dilakukan pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford. Metode Bradford merupakan metode kolorimetri dye-binding yang dipopulerkan oleh Marion M Bradford. Metode Bradford didasarkan pada interaksi asam amino dengan Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB G250) dalam kondisi asam. Metode Bradford merupakan metode yang lebih sederhana, inkubasi lebih cepat, lebih murah, kompatibel dengan agen pereduksi, dan lebih sensitif terhadap protein dibandingkan dengan metode Lawry (Kruger 1994; Cheng et al. 2016; Erns dan Zor 2010).

Metode Bradford memiliki 2 tipe pengujian yaitu microassay dan assay. Microassay digunakan untuk deteksi 1-10 µg protein, sedangkan assay digunakan untuk deteksi 10-100 µg protein (Kruger 1994). Kekurangan metode Bradford adalah tidak kompatibel dengan senyawa interferensi atau surfaktan (misalnya sodium dodecyl sulfate yang digunakan untuk melisiskan sel). Adanya surfaktan pada sampel menyebabkan kesetimbangan bergeser dan meningkatkan nilai absorbansi (Lozzi et al. 2008; Cheng et al. 2016). Selain itu reagen CBB G250 bersifat asam, sehingga hanya beberapa protein yang dapat diuji dengan menggunakan reagen tersebut. CBB G250 hanya bisa berikatan dengan asam amino basa (lisina, histidina, dan arginina) dan asam amino aromatik (triptofan, fenilalanina, dan tirosina) (Lozzi et al. 2008).

CBB G250 berwarna merah dan akan berwarna biru ketika berikatan dengan protein (kompleks pewarna-protein). Jumlah ikatan antara pewarna dengan protein dapat diukur pada panjang gelombang 595 nm. Kelompok asam sulfonat anion pada pewarna akan berpasangan dengan bagian kation pada asam amino lisin, arginin, histidin. Selain itu, pewarna juga dapat berikatan dengan asam amino nonopolar pada bagian hidrofobik (Sapan et al. 1999; Georgiou et al. 2008). Kadar protein ditentukan dengan persamaan linier yang dihasilkan dari pembuatan kurva standar. Kurva standar yang dihasilkan harus linier dan nilai R² yang dihasilkan mendekati 1, artinya korelasi antara nilai absorbansi dengan kadar protein berbanding lurus. Pembuatan kurva standar menggunakan protein standar. Protein standar yang digunakan dalam praktikum ini adalah Bovine Serum Albumin (BSA). Keuntungan menggunakan BSA adalah murah, mudah didapat, dan mudah larut. Selain itu BSA relatif stabil sehingga dapat digunakan untuk estimasi kadar protein.  

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengukur kadar protein sampel (A5 dan A10) dengan menggunakan metode Bradford dan nilai absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometri. 

METODE

Bahan

4,5 mL protein BSA (Bovin Serum Albumin) mg/mL, 4,5 mL aquades, reagen bradford (komposisi 0,025 gr coomassie brilliant blue G250, 12,5 mL etanol pa 95%, 25 mL asam ortofosfat dan aquades), 0,06 mL protein A10, dan 0,06 mL protein A5. 

Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, rak tabung, gelas ukur, mikropipet, kuvet, vorteks, neraca analitik, dan spektrofotometri.

  

Prosedur Praktikum

Praktikum ini dibagi menjadi 4 tahap yaitu pembuatan BSA sebagai protein standar, pembuatan reagen Bradford, pembuatan kurva standar, dan pengukuran kadar protein yang diperoleh dari perhitungan nilai absorbansi yang dimasukkan kedalam persamaan liner.

Pembuatan BSA

BSA ditimbang sebanyak 20 mg kemudian dilarutkan kedalam aquades sebanyak 20 mL lalu dihomogenkan. Selanjutnya sebanyak 4,5 mL BSA digunakan untuk pengujian kadar protein.

Pembuatan Reagen Bradford

Reagen Bradford dibuat dengan komposisi bahan yaitu 0,025 gr CBB G250, 12,5 mL etanol pa 95%, dan 25 mL asam ortofosfat. Semua bahan tersebut dicampurkan kemudian ditambah aquades hingga volume akhir mencapai 250 mL lalu disaring dengan kertas saring. 250 mL reagen Bradford tersebut merupakan stok pekat untuk 5 kali pengenceran. Reagen Bradford dibuat pekat untuk menghindari terjadinya oksidasi. Pembuatan reagen Bradford dengan 5 kali pengenceran adalah sebanyak 40 mL stok reagen Bradford diambil kemudian dimasukkan kedalam gelas ukur lalu ditambahkan aquades hingga volume akhir mencapai 200 mL.

Pembuatan Kurva Standar

Standar protein yang digunakan dalam penelitian ini adalah BSA. Sebanyak 11 tabung reaksi diisi dengan perbandingan BSA dan aquades yang berbeda yaitu 0:1; 0,1:0,9; 0,2:0,8; 0,3:0,7; 0,4:0,6; 0,5:0,5; 0,6:0,4; 0,7:0,3; 0,8:0,2; 0,9:0,1; 1:0 sehingga setiap tabung reaksi berisi 1 mL campuran akuades dan BSA. Selanjutnya diambil 60 µL dari setiap tabung kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi lain yang bersih. Setelah itu masing-masing tabung ditambahkan 3 mL reagen Bradford kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks lalu didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit agar terjadi reaksi antara reagen dengan protein. Absorbansi diukur dengan panjang gelombang 595 nm. Melalui pembuatan kurva standar akan dihasilkan persamaan regresi Y=ax+b yang digunakan untuk menentukan kadar protein terlarut.

Pengukuran Protein

Protein sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah A5 dan A10. Masing-masing protein diambil sebanyak 60 µL kemudian masing-masing ditambahkan 3 mL reagen Bradford lalu divorteks kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 595 nm. Hasil absorbansi pada masing-masing protein sampel disubtitusikan kedalam rumus persamaan regresi sehingga akan didapatkan kadar protein terlarutnya.

HASIL

Hasil dari praktikum ini adalah nilai-nilai absorbansi yang diperoleh dari pembacaan spektrofotometri. Tabel 1 menunjukkan nilai absorbansi yang dihasilkan dari hasil pembacaan spektrofotometri pada larutan protein standar BSA.

Tabel 1.  Nilai Absorbansi Protein Standar

BSA  (mL)	Akuades (mL)	Standar BSA (mg mL-1)	Absorbansi 595 nm
0	1	0	0,156
0,1	0,9	0,1	0,267
0,2	0,8	0,2	0,33
0,3	0,7	0,3	0,38
0,4	0,6	0,4	0,405
0,5	0,5	0,5	0,424
0,6	0,4	0,6	0,529
0,7	0,3	0,7	0,594
0,8	0,2	0,8	0,605
0,9	0,1	0,9	0,607

Nilai-nilai absorbansi yang terdapat pada Tabel 1 tersebut selanjutnya dapat digunakan untuk membuat kurva standar. Kurva standar yang dibuat dari protein standar BSA dapat dilihat pada Gambar 1.

Persamaan regresi yang didapatkan dari kurva standar BSA yaitu Y=0,4976x + 0,2058. Persamaan tersebut selanjutnya akan digunakan untuk menentukan kadar protein sampel (x) yaitu dengan cara subtitusi nilai absorbansi dari masing-masing protein sampel ke dalam persamaan regresi sebagai Y. Tabel 2 menunjukkan nilai absorbansi dan kadar protein sampel A5 dan A10. 

Tabel 2. Hasil Spektrofotometri dan Kadar Protein Sampel

Protein sampel	Nilai absorbansi 595 nm	Kadar protein (mg mL-1)
A5	0,479	0,549
A10	0,604	0,800

Penghitungan kadar protein sampel A5 dan A10 sebagai berikut.

Protein sampel A5:

Y = 0,4976x + 0,2058

0,479 = 0,4976x + 0,2058

0,4976x = 0,479 - 0,2058

x = 0,549

Protein sampel A10:

Y = 0,4976x + 0,2058

0,604 = 0,4976x + 0,2058

0,4976x = 0,604 - 0,2058

x = 0,800

PEMBAHASAN

Terbentuknya kurva linier menunjukkan hubungan antara absorbansi dengan kadar protein berbanding lurus. Semakin tinggi nilai absorbansi semakin tinggi kadar protein yang dihasilkan. Hubungan antara nilai absorbansi dan kadar protein ditentukan oleh nilai R². nilai R² yang sama dengan 1 atau mendekati 1 menunjukkan arti bahwa semakin kuat hubungan antara nilai absorbansi dan kadar protein. Meskipun sudah terlihat membentuk kurva linier namun nilai R² yang dihasilkan dari praktikum ini adalah 0,95. Nilai tersebut masih kurang akurat untuk menunjukkan hubungan antar variabel. Hal tersebut disebabkan oleh cara memipet yang kurang tepat sehingga mempengaruhi ketepatan dalam membuat konsentrasi larutan protein standar BSA. Selain itu hasil pembuatan kurva standar juga dipengaruhi oleh konsentrasi BSA dan kalibrasi alat spektrofotometri.

Pembuatan kurva standar menghasilkan persamaan regresi linier yaitu Y=0,4976x + 0,2058. Persamaan tersebut digunakan untuk mengetahui kadar protein sampel. Kadar protein sampel A5 sebesar 0,549 mg/mL sedangkan protein sampel A10 sebesar 0,800 mg/mL. Tingginya nilai absorbansi pada sampel protein menunjukkan dua kemungkinan, yaitu jumlah protein sebenarnya yang dapat diukur dengan metode Bradford atau jumlah protein sekaligus adanya senyawa interferensi yang menyebabkan meningkatnya absorbansi. Hal tersebut perlu untuk dipastikan yaitu dengan mengetahui kandungan protein sampel yang digunakan.

Metode Bradford menggunakan reagen berupa zat warna CBB G250. Sebelum direaksikan dengan protein, warna reagen bradford yang dalam kondisi asam karena adanya asam ortofosfat adalah merah. Setelah reagen ditambahkan kedalam tabung berisi protein maka warna yang terlihat adalah biru. Hal tersebut disebabkan adanya ikatan antara pewarna dengan asam amino penyusun protein. CBB G250 pada kondisi asam (kation) berwarna merah (absorbansi maksimum pada panjang gelombang 470 nm), pada kondisi netral berwarna hijau (absorbansi maksimum pada panjang gelombang 650 nm), dan pada kondisi basa (anion) berwarna biru (absorbansi maksimum pada panjang gelombang 595 nm) (Compton dan Jones 1985; Georgiou et al. 2008). Gambar 2 menunjukkan mekanisme CBB G250 berikatan dengan protein.  

Gambar 2 menjelaskan bahwa saat kondisi netral, CBB G250 berinteraksi dengan asam amino hidrofobik dan gugus sulfonat anion pada CBB G250 berikatan dengan bagian kation asam amino histidina, arginina, leusina. Saat kondisi basa (anion), asam amino hidrofobik tidak berinteraksi dengan CBB G250, sedangkan gugus sulfonat anion pada CBB G250 berikatan dengan bagian kation asam amino histidin, arginin, leusin. Saat kondisi asam (kation) tidak ada interaksi antara CBB G250 dengan asam amino (Georgiou et al. 2008.

SIMPULAN

Simpulan dari praktikum ini adalah kadar protein sampel A5 adalah 0,549 mg/mL dan kadar protein sampel A10 adalah 0,800 mg/mL.